<ins id="d1l3l"><noframes id="d1l3l"><cite id="d1l3l"></cite>
<del id="d1l3l"></del>
<cite id="d1l3l"></cite>
<cite id="d1l3l"><noframes id="d1l3l">
<cite id="d1l3l"><span id="d1l3l"></span></cite>
收藏我們 在線訂購

產品選擇指南

技術服務信息

機構用戶解決方案

當前位置:首頁 > 熱點關注
 
應用SMART® 技術快速克隆抗體可變區
 
SMARTer RACE cDNA Amplification
· 合成含有可變區全長序列的cDNA片段
· 輕松準確地克隆和分析多種抗體基因
· 改進RACE PCR實驗,更容易操作,無需連接酶克隆
 
升級的全長cDNA合成方法
    單克隆抗體已經被廣泛地應用于各種科學研究和診斷,而確切的抗原特異性是研究的關鍵點。另外,由于抗體工程(如嵌合抗體和人源抗體的發展)的進步,抗體生產技術的發展,將單克隆抗體直接應用于治療的可行性越來越高。
    由于抗原抗體特異性取決于抗體可變區的特異結構,分析可變區的序列是很多應用中的第一步,包括無動物系統的抗體生產,抗體作為藥物的研究,以及工程化抗體類似物的生產等。利用SMART cDNA合成技術和精簡的流程,SMARTer RACE kits提供了一個快速、簡便地分析這些重要的變化序列的方法。
 
可變區序列分析的解決方案
    免疫系統可以生產1億種抗體來對抗外界入侵物質。 抗體的這種多樣性通過淋巴細胞發育中V(D)J的重組而形成。抗體分子包含重鏈和輕鏈,重鏈和輕鏈又分別包含可變區和保守區,V(D)J 重組是可變區與其他基因序列幾乎隨機的重新組合。這個過程會生成特異的抗原受體。由于可變區位于重鏈和輕鏈的N端,且決定了抗原抗體的親和性,分析這段區域非常重要。
 
Figure 1. Basic antibody structure.
 
    分析可變區時,設計一個通用引物來擴增所有的抗體序列是異常困難的。重鏈和輕鏈5’端的天然可變性決定了序列同源性很低。一個有效的分析這些可變區域的方法是在可變區下游的保守區設計簡并引物。后續可以使用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法克隆這段目的區域,之后再進行測序。使用SMARTer RACE kits具有足夠的靈敏度,可以獲得全部5’端的信息。
 
SMARTer技術在RACE應用中的優勢
    使用SMARTer RACE cDNA擴增試劑盒,在反轉錄過程中將SMARTer II A寡核苷酸添加到cDNA的末端。該過程結合了Clontech特別的SMART(RNA模板5'末端的轉換機制)技術,允許反轉錄酶達到轉錄本的5'末端。大多數其他RACE PCR方法都沒有捕獲5'端,因此錯過了重要信息。此外,在5'末端添加SMART序列使得該位點能夠用于下游擴增和克隆。 SMARTer RACE組分和流程的優化大大減少了非特異性背景并提高了擴增效率。即使樣品被基因組DNA污染,強大的系統也能獲得可靠的結果,適用于廣泛的應用。用高保真聚合酶擴增cDNA片段確保了有效分析所需的核苷酸序列的準確復制。
 
小鼠雜交瘤來源抗體基因的快速克隆
    在克隆小鼠雜交瘤抗體基因之前,首先根據NCBI核酸數據庫注冊的小鼠lgG的序列,設計了針對H鏈, L (κ)鏈, 或L (λ)鏈的反轉錄引物(RT primer)以及RACE PCR所需的反向引物(5' RACE primer)。通過SMARTer RACE方法從total RNA合成了第一鏈cDNA后,直接進行5'-RACE PCR,這樣不僅可以獲得5’端序列,還可以獲得帶有可變區全部序列的cDNA片段。
 
Figure 2. Experimental workflow for 5′-RACE PCR of the antibody variable domain using the SMARTer RACE cDNA Amplification Kit.
 
    培養并確認小鼠雜交瘤細胞分泌由γ2a型重鏈和κ型輕鏈組成的單克隆抗體。提取total RNA,按照說明書protocol進行第一鏈cDNA合成和5'-RACE PCR,取一部分PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳確認。
 
Figure 3. Confirmation of successful amplification of antibody genes from mouse hybridomas.
 
    克隆擴增產物至pUC118后測序。確認序列包含單克隆抗體H鏈和L鏈N端氨基酸序列對應的ORF。
    我們對其他六種雜交瘤細胞系的抗體可變區進行同樣的基因序列分析。獲得了所有抗體亞類的PCR產物。分析序列后顯示,90%的H鏈克隆和50%的L鏈克隆序列準確編碼目標抗體蛋白質N端氨基酸序列。
    某些實驗中,得到的克隆與目標抗體具有序列同源性,但由于其序列中存在終止密碼子,因此不能編碼功能性抗體的ORF。另外,我們懷疑一個特定的克隆含有用于細胞融合的骨髓瘤細胞的轉錄物,因為該序列是從多個雜交瘤中獲得的。
    與編碼靶單克隆抗體的序列相比,一些雜交瘤產生了具有該共同序列的更多克隆。基于這些結果,顯然應該將靶抗體的N-末端氨基酸序列的分析和確認與DNA序列分析平行進行。
 
Figure 4. Amplification of various subclasses of mouse antibody genes.
 
SMARTer RACE cDNA的進一步改良,更簡化的克隆流程
    為了優化RACE流程,我們對SMARTer RACE Kit做了重大更新。上述數據是通過聯合使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit,PrimeSTAR® HS DNA Polymerase用于PCR,Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End) 用于連接和克隆。
    之后對產品升級,得到的SMARTer RACE 5'/3' Kit (Code No. 634858, 634859),具有同樣的SMARTer核心技術,并在反應條件和下游克隆方面進行了進一步的改良。 新試劑盒包含了SMARTer RACE實驗所需的所有組分(除了基因特異性引物外)。 通過將SMARTer II A寡核苷酸與SMARTScribe 反轉錄酶配對,獲得高靈敏度和特異性以及低背景的結果。
    SeqAmp DNA聚合酶提供了強大的PCR性能,在擴增長或富含GC的挑戰性靶序列時尤其有效。
    SMARTer RACE 5'/ 3'試劑盒的組成部分之一是In-Fusion® HD Cloning Kit,它可以在不使用連接酶的情況下輕松、準確地克隆5'-RACE片段。該試劑盒中還提供了與In-Fusion技術兼容的線性化載體,并且試劑盒中所包含的引物專門設計用于匹配該載體。 In-Fusion克隆方法非常高效,非常適合所有克隆應用。通過將這項技術與成熟的SMARTer RACE方法配合,從RNA到克隆只需要兩天時間就可以進行分析。
 
結論
    SMARTer RACE cDNA合成為抗體可變結構域的全長序列分析提供了靈敏、簡化的解決方案。這些可變區的多樣性雖然對有效免疫應答至關重要,但對于希望分析這些基因片段以進行廣泛研究(包括藥物開發)的研究人員來說,這是一項挑戰。
    獲得該序列后,使設計具有更好的體內穩定性、改善的親和力或雙重特異性的抗體成為可能。抗體可變區的評估是這些研究和許多其他抗體修飾的第一步,SMARTer 5'-RACE PCR是用于克隆這些靶序列進行測序的有效方法。
 
 
 
更多詳情請點擊:
SMARTer RACE 5'/3' Kit
 
 
 
 
 
天天啪啪,天天啪一啪,天天啪影院,啪啪在线影院免费